Quando se fala de PCR, DNA, biologia molecular, quase sempre pensamos em séries policiais, trabalho de peritos em cenas de crimes, entre outras coisas relacionadas à biologia forense. Porém a biologia molecular é uma poderosa ferramenta que ajuda em diversas áreas, como saúde humana e animal, conservação, melhoramento genético, entre outras. Aqui vamos falar do uso de uma técnica de biologia molecular sendo aplicada para saúde animal.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica muito utilizada e conhecida, que tem por objetivo amplificar um fragmento específico de DNA, também conhecido como produto de PCR. Mas como conseguimos esse produto? Primeiro precisamos do DNA “molde”, que pode ser obtido por meio de amostras de sangue, de mucosas que podem ser coletadas com a ajuda de um suabe (um tipo de cotonete), tecido (músculo, fragmentos de órgãos, etc.). A partir dessas amostras, é feita uma extração do DNA, seu método varia de acordo com o tipo de amostra, suas condições, quantidade de material, entre outros diversos fatores. Os protocolos de extração podem durar de algumas horas a dias a fim de se obter um DNA de qualidade para os próximos procedimentos.
Agora com o DNA extraído, precisamos de outros “ingredientes” para fazer a reação funcionar: os dideoxirribonucletídeos (dNTPs), primers foward e reverse, Taq polimerase e um mix de tampões para a PCR. Esses “ingredientes” são “misturados” em um microtubo para PCR (capacidade de 0,2 mL) e colocados em uma máquina chamada de termociclador, também conhecida como máquina de PCR. Nessa máquina é onde ocorre a reação, primeiro há uma elevação na temperatura, por volta de 95°C, para a “abertura” (desnaturação) da fita dupla de DNA, depois há uma queda na temperatura que permite a “ligação” (anelamento) dos primers na região de interesse; aí a temperatura é novamente elevada, dessa vez para um temperatura por volta de 72°C que permite a atuação da Taq polimerase adicionando os nucleotídeos no fragmento (extensão). Essas “trocas” de temperatura ocorrem diversas vezes que podem ocorrer de 20 a 40 ciclos. Ao fim da reação, conseguimos vários fragmentos do DNA.
E agora, como conseguimos ver se a reação funcionou? O método mais simples e barato é a eletroforese em gel de agarose. Então um gel de agarose é preparado, e colocado em uma “cuba” contendo uma solução eletrolítica e ligada a uma fonte elétrica. Como o DNA possui cargas negativas a amostra migra para o lado das cargas positivas. A velocidade de “migração” varia de acordo com o tamanho do fragmento, sendo os menores mais rápidos. Após a eletroforese, o gel é removido da cuba com cuidado e colocado sobre um transiluminador com luz ultravioleta (UV), caso a reação tenha funcionado, é possível visualizar as bandas.
Agora vamos ver uma das aplicações dessa técnica. Diversos animais são vítimas de tráfico todos os anos, devido ao egoísmo humano. Devido às más condições durante o transporte, manuseio, alimento e o estresse causado por essas, os animais ficam imunossuprimidos e sujeitos a doenças. A exemplo dos psitacídeos, é muito comum estarem infectados com a bactéria Chlamydophila psittaci, responsável pela clamidiose nesses e pela psitacose em humanos. O grande problema da doença, é a presença de animais infectados assintomáticos, pois podem transmitir o patógeno para outros animais imunossuprimidos que acabam sofrendo com a doença podendo morrer. Para a extração do DNA, são coletadas amostras de suabe da mucosa da cloaca ou dos olhos (caso o animal esteja com conjuntivite). Para a detecção da presença do patógeno, é necessário um par de primers específico que amplifique apenas na presença de C. psittaci. Para que o diagnóstico seja confiável, é preparado um tubo apenas com os reagentes sem DNA (controle negativo), para conferir se há contaminação e outro contendo um DNA de C. psittaci para conferir se todos os reagentes estão funcionando bem. Com isso, apenas amostras positivas para o alvo vão aparecer no gel confirmando o diagnóstico.
Além dessa bactéria é possível detectar outros patógenos, como Salmonella, desde que os primers que permitam sua identificação estejam disponíveis.
Esse é apenas um dos diversos métodos que nos fornecem dados sobre a saúde de animais que em conjunto auxiliam na tomada de decisão no tratamento dos mesmos.
Autora: Autora: Grécia Mikhaela Nunes de Lima
Referências:
Khan Academy. Reação em cadeia da polimerase (PCR). Disponível em: . Acesso em: 2 de abril de 2020.
Santos, F., Leal, D. C., Raso, T. D. F., Souza, B. M. P. S., Cunha, R. M., Martinez, V. H. R., … & Franke, C. R. (2014). Risk factors associated with Chlamydia psittaci infection in psittacine birds. Journal of medical microbiology, 63(3), 458-463.